Reinigung und Charakterisierung von mTMEM16A und der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors für die 2D-Kristallisation

Strukturelle Charakterisierung der C-terminalen Endodomäne des hP2X7-Rezeptors

Der P2X7-Rezeptor (P2X7R) gehört zur P2X-Rezeptorfamilie ATP-gesteuerter

Kationenkanäle. Die sieben Isoformen (P2X1-P2X7) teilen eine gemeinsame Topologie mit

zwei Transmembranregionen, einer großen extrazellulären Schleife und intrazellulären N- und

C-terminalen Domänen. Drei Untereinheiten einer Isoform assemblieren zu einem

funktionellen homotrimeren Rezeptor. Aufgrund seiner Lokalisation in Zellen mit Beteiligung

an Schmerzentstehung, Entzündungsprozessen und neurodegenerativen Erkrankungen ist der

P2X7R ein interessanter Angriffspunkt für die Entwicklungen neuer Arzneimittel gegen

verschiedene Krankheiten. Strukturell unterscheidet sich die 595 Aminosäuren umfassende

P2X7R-Untereinheit von anderen P2XR-Subtypen (P2X1R-P2X6R) durch eine um 120-200

Aminosäuren längere C-terminale Endodomäne. Funktionelle und biochemische Daten, die

von unserer Arbeitsgruppe zusammen mit der Arbeitsgruppe von Prof. Markwardt in Halle

publiziert wurden (Becker et al., 2008), lassen den Schluss zu, dass die C-terminale

Endodomäne des P2X7-Rezeptors ein Gating-Modul darstellt, wobei eine trimere Anordnung

des Moduls zur trimeren Struktur der P2X7-Rezeptoren passen würde. Modelle, wie solche

cytoplasmatische Domänen das Öffnen von Ionenkanälen regulieren, wurden bereits für

spannungsabhängige K+-Kanäle durch Kombination funktioneller Daten mit Kristallographie-

Strukturdaten abgeleitet. Die C-terminale Endodomäne des hP2X7-Rezeptors (hP2X7

355-595-

Protein) wurde in dieser Arbeit in der methylotrophen Hefe P. pastoris überexprimiert und

durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Optimierung der

Aufreinigungsbedingungen konnte ~1,5 mg hP2X7

355-595-Protein in hoher Reinheit pro Liter

Kulturmedium aufgereinigt werden. 2D-Kristallisationsversuche mit dem

His-hP2X7

355-595-Protein wurden in Kooperation mit Prof. Schmidt-Krey an der Fakultät für

Biologie am Georgia Institute of Technology in Atlanta im Rahmen eines einjährigen

Aufenthalts durchgeführt. Durch die Optimierung der Kristallisationsparameter Lipid-Protein-

Verhältnis (LPR), Salz sowie Temperatur wurde die Ausbildung von DMPC-

Membranstrukturen günstig beeinflusst und eine Abnahme von zuvor vorhandenen

Proteinaggregaten beobachtet. Nach elektronenmikroskopischer Auswertung der Proben

zeigte sich, dass es durch DMPC-Zugabe, in einem Lipid-Protein-Verhältnis von 1 bis 5, zu

einer Stabilisierung des His-hP2X7

355-595-Proteins kommt. Durch Zugabe von NaCl zum

Dialysepuffer konnte die Ausbildung von DMPC-Membranen gefördert werden. Eine

Rekonstitution des His-hP2X7

355-595-Proteins in die DMPC-Doppelschicht und eine

Ausbildung von kristallinen Bereichen konnte allerdings mit keiner der

Parameterveränderungen mit Sicherheit beobachtet werden. Die Optimierung weiterer

Kristallisationsparameter ist daher Gegenstand aktueller Untersuchungen.

Expression und Reinigung von TMEM16A für 2D-Kristallisationsexperimente

Die TMEM16A/Anoctamin-Kanäle konnten 2008 unabhängig von drei Arbeitsgruppen als

lang gesuchte Ca2+-aktivierte Chloridkanäle identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppe

konnte mittels BN-PAGE-Analyse und Crosslinking-Experimenten erstmals gezeigt werden,

dass das in X. laevis-Oozyten und HEK293-Zellen exprimierte TMEM16A-Protein stabil zu

Homodimeren oligomerisiert und in homodimerer Form auch in der Plasmamembran dieser

Zellen vorliegt (Fallah et al., 2010, Molecular & Cellular Proteomics,). Ziel der fortführenden

Arbeit war es, das TMEM16A-Protein in Milligramm-Mengen zu exprimieren und zu

reinigen, um es für strukturelle Untersuchungen mittels der 2D-Kristallisation verfügbar zu

machen. Eine wichtige Frage war die Identifizierung von Detergenzien, die TMEM16A

schonend solubilisieren und gleichzeitig für die Kristallisation geeignet sind. Durch ein

umfassendes Screening konnte das nicht-ionische Detergenz C8E4 sowie das

Detergenziengemisch CHAPS und Triton X-100 als Detergenzien identifiziert werden, in

denen sich TMEM16A als stabiles Homodimer verhält. In anderen untersuchten nicht-

ionischer und zwitterionischen Detergenzien lag TMEM16A im nicht-denaturiertem Zustand

in unterschiedlichen prozentualen Verhältnissen als Monomer und Dimer vor. Durch

Kultivierung in einem Spinner-System im Litermaßstab und affinitätschromatografischer

Aufreinigung gelang es, rekombinantes TMEM16A im Milligramm-Mengen in einer Qualität

zu isolieren, wie sie für die 2D-Kristallisation benötigt wird. Als weiteres Expressionssystem

neben HEK293-Zellen erwiesen sich Sf158-Insektenzellen als geeignet, Milligramm-Mengen

an homodimeren TMEM16A-Protein zu produzieren. Im Vergleich zu den in HEK293-Zellen

exprimierten TMEM16A wies das Protein in Insektenzellen ein anderes

Glykosylierungsmuster auf. Erste 2D-Kristallisationsexperimente mit dem aufgereinigten

TMEM16A werden zurzeit im Labor von Prof. Schmidt-Krey am Georgia Institute of

Technology durchgeführt.