Assoziation Zwischen Dem Verlust Des Tuberose-Sklerose-Gen-2-Produktes Tuberin Und Angiogenese

Das Wachstum von Tumoren in mehrzelligen Organismen ist von der Entwicklung der Angiogenese abhangig. Storungen in der Zellregulierung konnen zur Expression von angiogenetischen Wachstumsfaktoren und folglich zur Tumorgenese fuhren. In den letzten Jahren konnte bei vielen Tumorerkrankungen gezeigt werden, dass der Verlust von Tumorsuppressorgenen zur Angiogenese beitragt. Bei der Tuberosen Sklerose (TS), einer autosomal dominant-vererbten Erkrankung, ist die Ursache der Tumorbildung in den verschiedenen Organen die Mutation von zwei Tumorsuppressorgenen, dem TSC1-Gen oder dem TSC2-Gen. Die kodierten Proteine heissen Hamartin (fur TSC1) und Tuberin (fur TSC2). In der vorliegenden Arbeit wird eine Assoziation zwischen dem Verlust des TSC2-Gens und der Angiogenese beschrieben. Angiofibrome sind eine Manifestation der TS. Sie bestehen aus vaskularen und interstitiell bindegewebigen Elementen der Haut. In Voruntersuchungen konnte der Verlust von Tuberin im interstitiellen Teil der Angiofibrome gezeigt werden. Immunhistochemische Analysen von Angiofibromen wurden mit Hilfe von Antikorpern gegen angiogenetische Wachstumsfaktoren durchgefuhrt. In allen 10 untersuchten Angiofibromen wurden die Wachstumsfaktoren VEGF, Angiogenin, bFGF, PD-ECGF und PDGF-B in den interstitiellen und vaskularen Zellen detektiert. Die Expression von TGF-ss und Il-8 wurde kaum beobachtet. Dies suggeriert, dass diese Wachstumsfaktoren das Wachstums des vaskularen Anteils vermitteln. Der Eker-Ratten-Stamm, ein naturlich vorkommendes Tiermodell mit erblichen Nierentumoren, tragt eine heterozygote Mutation des TSC2-Gens. Homozygote TSC2-negative Nachkommen dieser Ratten sterben bereits im Uterus. Von diesen Embryonen entnommene und kultivierte Zellen liefern TSC2-negative Fibroblasten (TSC2(- /- )REF), ein geeignetes Modell, um die angiogenetische Kapazitat dieser Zellen im Vergleich zu normalen embryonalen Fibroblasten (TSC2(+/+)REF) zu erforschen. Kulturuberstande von TSC2(- /- )REF stimulierten das Wachstum der humanen mikrovaskularen Endothelzellen signifikant um 75-79% mboxpm10-23% mehr als Kulturuberstande der TSC2(+/+)REF. Initial fur die Migration von Endothelzellen ist die Umorganisation des Zytoskeletts. Eine Bildung von Aktinstressfasern von Endothelzellen wurde durch Medium der TSC2(- /- )REF nach 2h hervorgerufen. Die stimulierten Endothelzellen streckten sich in die Lange, wahrend die anderen, die mit Medium der TSC2(+/+)REF inkubiert wurden, polygonal blieben. Um nach den relevanten Wachstumsfaktoren zu analysieren, wurden mit mehreren Antikorpern gegen Wachstumsfaktoren, wie anti- Angiogenin, -bFGF und -VEGF Neutralisationsversuche durchgefuhrt. Die Stimulation der Proliferation der Endothelzellen durch die TSC2(- /- )REF war um 56% mboxpm21% reduziert, wenn Anti-VEGF-Antikorper zu dem Zellkulturmedium hinzu gegeben wurden. Anti-Angiogenin und Anti-bFGF hatten keinen Effekt. Die zellulare Expression der VEGF-mRNA wurde in einer semiquantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten-Reaktion bestimmt. VEGF-mRNA war in den TSC2(- /- )REF doppelt so viel vorhanden wie in den TSC2(+/+)REF. Der losliche Anteil an sezerniertem VEGF im Kulturuberstand der REF wurde mittels metabolischer Markierung mit radioaktivem 35 S] -Methionin und Immunprazipitation durch Anti-VEGF-Antikorper bestimmt. Die Menge an gefalltem VEGF im Medium der TSC2(- /- )REF war deutlich grosser als die Menge im Medium der TSC2(+/+)REF. Um den Verlust von Tuberin der TSC2(- /- )REF zu der angiogenetischen Eigenschaft dieser Zellen zu zuordnen, musste das fehlende Gen rekonstituiert werden. Nach der Einfuhrung der TSC2-cDNA in den TSC2(- /- )REF mittels des Vektors pcDNA3/TSC2 und des retroviralen Vektors pLXIN/TSC2 wurde getestet, ob das wieder vorhandene Gen die Angiogenese hemmen konnte. Sobald die Zellen wieder Tuberin exprimierten, wurde die Proliferation der Endothelzellen gemessen, die zuvor mit Uberstanden der TSC2-reexprimierende TSC2(- /- )REF stimuliert wurden. Die Proliferation der Endothelzellen reduzierte sich bei der Stimulation mit Kulturuberstanden von TSC2(- /- )REF, die mit TSC2 transfiziert waren, abhangig vom Transfektionsvektor: pcDNA3/TSC2-Massenkulturen um 30% mboxpm16%, pLXIN/TSC2-Massenkulturen um 50-55% mboxpm8-22% und pLXIN/TSC2-Klonen um 12-16% mboxpm10% reduziert. Die Aktinstressfaserbildung der Endothelzellen blieb nach Stimulation mit Medium von TSC2-reexprimierenden TSC2(- /- )REF aus. Die Sezernierung des VEGF in das Medium reduzierte sich ebenfalls bei den TSC2(- /- )REF, die TSC2 reexprimierten. Dies deutet darauf hin, dass Tuberin bei der Inhibition der Angiogenese eine Rolle spielt und dass ein funktioneller Verlust von Tuberin/TSC2 zur Angiogenese beitragt.